دانلود تحقیق c (3124)

دانلود تحقیق c (3124)

1-4-5. آدنیلات سیکلاز (ACT)16
1-4-6. تراکئال سایتو توکسین (TCT)17
1-4-7. توکسین حساس به حرارت18
1-4-8. BrKA18
1-4-9. اندوتوکسین19
1-5. سویه های بوردتلا پرتوسیس 19
1-6. اپیدمیولوژی 20
1-6-1. وضعیت بیماری در ایران21
1-7. بیماری زایی سیاه سرفه 21
1-8. علائم کلینیکی 22
1-9. تشخیص بیماری 23
1-9-1. تشخیص بالینی23
1-9-2. علائم کلینیکی در نوزادان24
1-9-3. کودکان، نوجوانان و بزرگسالان25
1-10. پاسخ ایمنی در برابر سیاه سرفه 26
1-10-1. پاسخ ایمنی همورال27
1-10-2. پاسخ ایمنی سلولی28
1-11. روش های آزمایشگاهی تشخیص.30
1-11-1. کشت30
1-11-2. سرولوژی30
1-11-3. PCR 32
1-12. مدیریت بیماری33
1-13. پیشگیری 34
1-13-1. راهبردهای بالقوه در مهار بیماری سیاه سرفه در اوایل نوزادی35
1-13-1-1. واکسیناسیون بالغین و سالمندان37
1-13-1-2. حفاظت غیرمستقیم نوزادان از طریق واکسیناسیون والدین37
1-13-1-3. ایمن سازی نوزادان و کودکان38
1-13-1-4. واکسیناسیون مادر در دوران بارداری38
1-14. استراتژی های واکسن39
1-14-1. واکسن غیر سلولی سیاه سرفه39
1-14-2. واکسن سلولی سیاه سرفه40
فصل دوم: مروری بر متون گذشته
2-1. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه42
2-1-1. تعریف تست کنترل سمیت زدایی (MWGT) 43
2-1-2. تعریف تست حفاظتی داخل مغزی موش (تست توانمندی Potency test) 44
2-1-3. ابداع روش کشت44
2-1-4. جداسازی سلول باکتری از کشت45
2-2. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه در انستیتو رازی46
2-3. غیرفعال سازی سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه47
2-3-1. استفاده از فرمالین و تیومرسال برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه47
2-3-2. استفاده از گلوتار آلدهید برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه49
2-3-3. استفاده از حرارت برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه49
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1. تجهیزات و وسایل 51
3-2. مواد و محیط ها 52
3-2-1. محیط کشت آگار بورده ژانگو52
3-2-2. محیط کشت وِروِی53
3-2-3. محیط B254
3-2-4. محیط کشت سویابین کازئین54
3-2-5. محیط تیوگلیکولات براث55
3-3. روش کار 56
3-3-1. انتخاب سویه های بوردتلا پرتوسیس56
3-3-1-1. لیوفیلیزه کردن56
3-3-2. کشت باکتری سیاه سرفه56
3-3-2-1. کشت تجدید حیات روی محیط بورده ژانگو56
3-3-2-2. کشت بذر روی محیط وِروِی57
3-3-2-3. مراحل انجام کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه57
3-3-2-3-1. استریلیزاسیون فرمانتور57
3-3-2-3-2. آماده سازی و بهینه سازی محیط کشت فرمانتوری58
3-3-2-3-3. تلقیح بذر به محیط کشت در فرمانتور58
3-3-3. جداسازی باکتری سیاه سرفه از محیط کشت59
3-3-3-1. جداسازی سلول باکتری با استفاده از سانتریفوژ59
3-3-3-2. جداسازی سلول باکتری با استفاده از سیستم میکرو فیلتراسیون59
3-3-4. غیرفعال سازی سلول باکتری سیاه سرفه60
3-3-5. سمیت زدایی سوسپانسیون باکتری سیاه سرفه60
3-3-5-1. سمیت زدایی با استفاده از فرمالین61
3-3-5-2. سمیت زدایی با استفاده از تیومرسال61
3-3-6. تست های کنترلی سوسپانسیون سیاه سرفه61
3-3-6-1. تست استریلیتی61
3-3-6-2. تست کنترل غیرفعال بودن باکتری62
3-3-6-3. تست کنترل سمیت زدایی (MWGT) 62
3-3-6-4. تست توانمندی62
فصل چهارم: نتایج
4-1. تجدید حیات بذر بر روی محیط بورده ژانگو64
4-2. تهیه بذر در محیط وِروِی64

4-3. کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن64
4-4. جداسازی باکتری سیاه سرفه از کشت67
4-5. غیرفعال سازی و سمیت زدایی باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن69
4-5-1. سمیت زدایی با فرمالین69
4-5-2. سمیت زدایی با تیومرسال69
4-6. آزمایش های کنترلی سوسپانسیون های سیاه سرفه69
4-7. نتایج حاصل از آزمون MWG در کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه
سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال72
4-8. آزمون MWG و مقایسه تغییرات اوزان موش ها75
4-9. تست توانمندی واکسن های آزمایشی سیاه سرفه80
فصل پنجم: بحث و پیشنهادات
بحث 83
نتیجه گیری و پیشنهادات 88
منابع89
خلاصه انگلیسی 97
ضمایم 98
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول1-1. آنتی ژن های مختلف سیاه سرفه9
جدول1-2. علائم کلینیکی بیماری سیاه سرفه26
جدول1-3. آنتی بیوتیک های مورد استفاده در درمان سیاه سرفه حاد و رژیم مصرف آن34
جدول1-4. واکسیناسیون سیاه سرفه در کشورهای مختلف36
جدول2-1. ترکیب محیط لیستر و B2 بر اساس گرم در لیتر45
جدول3-1. لیست دستگاه ها و تجهیزات مورد استفاده51
جدول3-2. لیست مواد و محیط های مورد استفاده در تولید واکسن سیاه سرفه52
جدول3-3. ترکیبات محیط بورده ژانگو53
جدول3-4. ترکیبات محیط کشت وِروِی53
جدول3-5. ترکیبات محیط کشت B254
جدول3-6. ترکیبات محیط کشت سویابین کازئین55
جدول4-1. اطلاعات دوره کشت باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن68
جدول4-2. نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باکتری سیاه سرفه سمیت زدایی شده با فرمالین70
جدول4-3. نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باکتری سیاه سرفه سمیت زدایی شده با تیومرسال71
جدول4-4. نتایج حاصل از کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال با استفاده از آزمون MWG73
جدول4-5. نتایج کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین با استفاده از آزمون MWG76
جدول4-6. نتایج کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با تیومرسال با استفاده از آزمون MWG77
جدول4-7. نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین (FDV)80
جدول4-8. نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با تیومرسال (TDV)81
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار1-1. مقایسه تعداد افراد زیر یک سال ایمن شده با واکسن DTP در سه کشور مختلف در سال
2000 تا 2010 6
نمودار4-1. تغییرات pH کشت سویه 134 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور65
نمودار4-2. تغییرات pH کشت سویه 509 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور65
نمودار4-3. مقایسهی میانگین جذب نوری در طول موج های530 و590 در مقدار جرم باکتری در هنگام برداشت در بچ های مختلف سویه 134 و 50966
نمودار4-4. مقدار غلظت نهایی باکتری سیاه سرفه (cell109×1) سویه 134 در پایان دوره کشت در هنگام برداشت66
نمودار4-5. مقدار غلظت نهایی باکتری سیاه سرفه (cell109×1) سویه 509 در پایان دوره کشت در هنگام برداشت67
نمودار4-6. مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه سویه 134 توسط فرمالین و تیومرسال با استفاده از تست MWG 74
نمودار4-7. مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه در سویه 509 توسط فرمالین و تیومرسال با استفاده از تست MWG74
نمودار4-8. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واکسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین نسبت به تیومرسال در سویه 13478
نمودار4-9. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واکسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین
نسبت به تیومرسال در سویه 50978
نمودار4-10. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با سوسپانسیون های سمیت زدایی شده سویه 134 با تیومرسال و فرمالین نسبت به موش های گروه کنترل79
نمودار4-11. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده توسط واکسن سیاه سرفه حاصل از سمیت
زدایی با فرمالین وتیومرسال در سمیت زدایی درسوش509 توسط تست MWG 79
نمودار4-12. مقایسه نتایج حاصل از توانمندی واکسن های تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین (FDV) با واکسن های تجربی سمیت زدایی شده با تیومرسال((TDV 81
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل1-1. کوکوباسیل سیاه سرفه7
شکل1-2. اتصال بوردتلا پرتوسیس به سلول های پوشش مژه دار مجاری تنفسی9
شکل1-3. شمای شماتیک از پرتوسیس توکسین11
شکل3-1. فرمانتور استفاده شده برای کشت سیاه سرفه58
خلاصه فارسی
سیاه سرفه بیماری عفونی باکتریال دستگاه تنفس است که عامل آن بوردتلا پرتوسیس از دسته باکتری های گرم منفی می باشد. در این مطالعه شش بچ از سویه های 134 و 509 باکتری سیاه سرفه تهیه شده و مورد مقایسه قرار گرفتند. از دو روش فیزیکی سانتریفوژ و میکروفیلتراسیون برای جداسازی سلول باکتری از محیط کشت استفاده گردید. سپس سلولهای جداسازی شده باکتری درPBS خنک و استریل در غلظت متوسط Ou/ml 150-100 حل شده و به دو قسمت تحت نامهای سوسپانسیون سمیتزدایی با فرمالین (FD) و سوسپانسیون سمیت زدایی با تیومرسال (TD) تقسیم شدند. به سوسپانسیون هایFD بعد از غیرفعال سازی در حرارت 56 درجه سانتیگراد بمدت 10 دقیقهmM 10فرمالین (7/37 %) اضافه گردید و به سوسپانسیون هایTD در شرایط مشابه، بعد از غیرفعال سازی با حرارت، w/v 01/0 % تیومرسال بصورت محلول اضافه شد. سپس هر دو سوسپانسیون در دمای 8-4 درجه سانتیگراد برای سمیت زدایی انکوبه شدند. در روزهای 10، 30، 90، 180 و 270 از هر دو نوع سوسپانسیون نمونه برداری شد تا سمیت آنها با انجام تست افزایش وزن موش (MWG) مورد ارزیابی قرار گیرد. در نهایت نیز شش واکسن آزمایشی FD وTD از مخلوط کردن غلظت های مشابه دو سویه 134 و 509 تهیه گردید تا بتوان توانمندی این واکسن ها را در تست حفاظتی موش با تستKendrick ارزیابی نمود. نتایج حاکی از آن بود که روش سمیت زدایی با فرمالین با میانگین دوره 6/26 روز در مقایسه با روش سمیت زدایی با تیومرسال با میانگین دوره 195 روز، روش کوتاهتری از نظر زمانی برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه است. توانمندی واکسن تجربی حاصل از سمیت زدایی با فرمالین با میانگین 9/5 از واکسن تجربی حاصل از سمیت زدایی با تیومرسال با میانگین 95/5 قدری کاهش را نشان داده است. براساس نتایج حاصل، فرمالین با کاهش دوره سمیت زدایی در درجه حرارت 8-4 درجه سانتیگراد بمیزان 5/7 برابر بسیار مناسب تر از تیومرسال بود. اگرچه توانمندی واکسن حاصل از روش سمیت زدایی با تیومرسال حدود 05/0 واحد بیشتر از واکسن حاصل از سمیت زدایی با فرمالین است ولی تفاوت از نظر آماری ناچیز بود.
کلیدواژهها: بوردتلاپرتوسیس- سمیت زدایی- تیومرسال- فرمالین- تست افزایش وزن موش (MWG) – تست حفاظتی موش با تست kendrik
فصل اول
کلیات
1-1. بیان مسأله
بیماری سیاه سرفه یک عفونت تنفسی بوده که توسط باکتری بوردتلا پرتوسیس1 از دسته باکتریهای گرم منفی ایجاد می شود. نشانه عمده بیماری سرفه هایی است که ممکن است تا چند هفته نیز طول بکشد که مشخصه آن پاروکسیزمال2 شدید با سرفه های ناگهانی است که اغلب خاتمه آن با یک دم همراه می باشد. بیماری در نوزادان و اطفال بیشتر رخ می دهد (2و18).
در تولید واکسن سلولی سیاه سرفه به روش سنتی و جاری آن در مؤسسه واکسن و سرم سازی رازی جدا سازی باکتری به روش ترسیب با اسیدکلریدریک انجام گرفته و سپس به منظور سمیت زدایی3 توکسین های موجود در سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه از تیومرسال و انکوباسیون درسردخانه به مدت طولانی 12-9 ماه استفاده می گردد. جدا سازی جرم باکتری با استفاده از اسید از یک سو و فرآیند طولانی سمیت زدایی با مرتیولات از سوی دیگر منجر به کاهش توانمندی واکسن می گردد. لذا در این پروژه با جایگزینی روش های جدا سازی فیزیکی باکتری از محیط کشت بجای روش شیمیایی از یک سو آسیبهای احتمالی به ساختار سلولی باکتری را کاهش داده و از سوی دیگر با استفاده از فرمالین بجای تیومرسال زمان مورد نیاز برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه به حداقل تقلیل یافت تا ضمن کاهش دوره فرآوری آنتی ژن بتوان فرآورده ای با کیفیت مناسب تر را تولید نمود (4).
1-2. تاریخچهی بیماری سیاه سرفه
اولین شیوع بیماری سیاه سرفه توسط Guillame De Baillou شناخته شد که اپیدمی آن در تابستان 1578 در پاریس اتفاق افتاد (11). بیشترین اثراین اپیدمی بر روی نوزادان و اطفال بود که باعث ایجاد مرگ و میر بالایی شد. ظاهراً بیماری قبلاً در فرانسه شناخته شده است، زیرا De Baillou به پنجمین اسم مشترک این بیماری اشاره کرده است. او فرض می کرد بیماری باید به صورت صدای سرفه یا 5 ساعت تشنج متناوب منعکس شود. یک بیماری از 16 قرن پیش مانندchyne-cough شناخته شده که شاید پرتوسیس بوده باشد و در سال 1701 در لندن مدت ها سیاه سرفه وchyne-cough به صورت مرگ و میر ظهور می کرده است (12). سیدنهام اصطلاح پرتوسیس را به هر بیماری که با سرفههای شدید همراه بود اطلاق کرد ولی این نام در اواسط قرن هجدهم به بیماری همه گیری محدود شد که ماهیت بالینی مشخص داشت (2).
بوردت (Bordet) و ژانگو (Gengou) اولین افرادی بودند که باکتری سیاه سرفه را در سال 1906 در آزمایشگاه کشت دادند و چندی بعد واکسن خام بر علیه این باکتری ساخته شد (22).
اولین واکسن سیاه سرفه توسطMedcen در سال 1933 تهیه شد. در این روش سلول های باکتری سیاه سرفه از محیط کشت جدا و سپس با استفاده از گرما غیر فعال شدند (60).
قبل از استفاده گسترده از واکسن سلولی سیاه سرفه4، در آمریکا 270000 مورد بیماری سیاه سرفه هر سال با بیش از 10000 مرگ و میر گزارش شده است (11).
وقوع بیماری سیاه سرفه بعد از واکسیناسیون جمعی کودکان در دهه ی 1940 با واکسن سلولی به طور چشمگیری کاهش پیدا کرد و بیشترین کاهش آن در سال 1976 با تعداد 1010 نفر بیمار گزارش شده است (54).
اما از آن به بعد شیوع بیماری دوباره سیر صعودی پیدا کرد که بیشترین افزایش از سال 1959 به بعد بود که بیش از 2500 نفر در سال 2004 به بیماری مبتلا بودند. افزایش این بیماری در آمریکا در بین اطفال و بزرگسالان احتمالاً ناشی از کمشدن ایمنی القا شده توسط واکسن و همچنین افزایش امتناع از واکسیناسیون در این گروه سنی بوده است. از آنجا که غالباً بیماری سیاه سرفه تشخیص داده نمیشود بنابراین تعداد واقعی بیماری از تعداد گزارش شده خیلی بیشتر می باشد. گزارشات سال 2008 هم نشان میدهد که شیوع این بیماری در نوزادانی که سن آنها به سنی نرسیده که سه دوز از واکسن محتوی سیاه سرفه را دریافت نمایند در حال افزایش می باشد (18).
در طول سال های 2000 الی 2004 بطور متوسط سالانه 2488 مورد از این بیماری در آمریکا گزارش شده که شامل کودکان کمتر از یک سال است که 63% آنها در بیمارستان بستری شده اند (22).
سیاه سرفه در سراسر جهان یک مشکل مهم در کودکان بشمار می آید. سازمان جهانی بهداشت5 (WHO) اعلام کرده است که سالانه در جهان 45 میلیون مورد از این بیماری دیده می شود که از این تعداد 301408 نفر از کودکان در سال 2002 تلف شده اند (18).
علی رغم اینکه بیش از 6 دهه از تاریخ واکسیناسیون مدرن می گذرد، سیاه سرفه هنوز هم یکی از رایج ترین بیماری هایی است که توسط واکسن قابل پیشگیری است. گزارش شده است که بیماری سیاه سرفه در برخی از جمعیت های واکسینه شده در سال های 1980 و 1990 دوباره عود داشته است (8).
یکی از عوامل مهمی که واکسیناسیون نتواند ایمنی کامل ایجاد کند آداپته شدن پاتوژن با سیستم ایمنی و کاهش القای سیستم ایمنی توسط واکسن می باشد (48).
با وجود پوشش بالای واکسیناسیون، بیش از پانزده سال است که بازگشت عفونت سیاه سرفه در سراسر جهان مشاهده می شود. در حالی که بیماری کلاسیک سیاه سرفه در دوران قبل از واکسیناسیون در درجه اول، یک بیماری دوران کودکی بوده، امروزه با واکسیناسیون گسترده، بروز بیماری بیشتر به نوجوانان و بزرگسالان انتقال یافته است.
آمار ارائه شده توسط مراکز کنترل بیماری و پیشگیری6 (CDC) از سال 2004 نشان می دهد موارد بیماری در افراد سنین 19-10 سال بمیزان 19برابر و در افراد بالاتر از 20 سال به 16 برابر افزایش یافته است (22).
در واقع نوجوانان و بزرگسالان نقش قابل توجهی در انتقال سیاه سرفه به نوزادان و کودکانی دارند که نسبت به بروز عوارض بیماری و مرگ و میر ناشی از آن آسیب پذیرتر می باشند.
نمودار 1-1 مقایسه تعداد افراد زیر 1سال ایمن شده با واکسنDTP در سه کشور مختلف در سال 2000 تا 2010
از عوامل متعدد در افزایش بروز بیماری سیاه سرفه میتوان از نقصان عملکرد ایمنی پس از عفونت طبیعی و یا حتی خود واکسیناسیون نام برد. لذا بمنظور جلوگیری ار انتقال بیماری از نوجوانان و بزرگسالان به نوزادان و کودکان گسترش استراتژی واکسیناسیون از جمله ایمن سازی جهانی نوجوانان و بزرگسالان بخصوص، کارکنان بهداشت، پرستاران کودکان و والدین نوزادان، میتواند به کنترل بیماری سیاه سرفه کمک شایانی نماید. سیاه سرفه یک تهدید جدی برای نوزادان و کودکان و تا حد زیادی نوجوانان و بزرگسالان است از اینرو، افزایش آگاهی پزشکان با بیماری سیاه سرفه و روش های استاندارد تشخیص آن و عمل به استراتژیهای مختلف واکسیناسیون برای افزایش کنترل این بیماری حائز اهمیت بود (22).
درسراسر جهان، سالانه50 میلیون مورد سیاه سرفه اتفاق می افتد که %90 در کشورهای در حال توسعه می باشد. نوزادان، گروه آسیب پذیر با بالاترین میزان عوارض و مرگ و میرهستند، با این حال کودکان، نوجوانان و بزرگسالان در حال حاضر درصد قابل توجهی از موارد را تشکیل می دهند و یک منبع انتقال عفونت به نوزادان هستند.
PCR، کشت و سرولوژی روشهای اصلی تشخیص آزمایشگاهی سیاه سرفه بوده که عوامل مختلفی بر حساسیت و ویژگی هر یک از روش های مذکور مؤثر می باشد. با این حال، در سالهای اخیر، PCR به یک روش مناسب با تأثیر قابل توجه در افزایش تشخیص آزمایشگاهی سیاه سرفه تبدیل شده است (22).
1-3. باکتریولوژی
عامل ایجاد کننده سیاه سرفه، یک باسیل کوچک گرم منفی و پلی مورف است (شکل1-1). اگرچه ارگانیسم صد سال پیش در ترشحات و نمونه های پاتولوژیک کودکان مبتلا به بیماری سیاه سرفه شناسایی شده بود ولی این ارگانیسم تا سال 1906 که بوردت (Bordet) و ژانگو (Gengou) با استفاده از محیط کشت مخصوص موفق به کشت آن در آزمایشگاه شدند، تکثیر نشده بود. هنوز در بسیاری از آزمایشگاه ها از محیط بوردت-ژانگو برای تکثیر این باکتری استفاده می نمایند.
تاکنون محیط های سنتتیک مختلفی برای رشد و تکثیر این باکتری برای تولید واکسن طراحی و بکار گرفته شده است (18).
شکل1-1.کوکوباسیل سیاه سرفه
دو ارگانیسم دیگر نیز در جنس بوردتلا به نام بوردتلا پاراپرتوسیس 7و بوردتلا برونشی سپتیکا8 وجود دارد که پاراپرتوسیس مسئول سندرمی شبیه پرتوسیس در انسان است که معمولاً شدتش از پرتوسیس کمتر است. برونشی سپتیکا بیماریهای تنفسی در حیوانات خانگی را ایجاد می کند. چون ساختارهای DNA این دو ارگانیسم به طور ضروری همانند بوردتلا پرتوسیس است، ممکن است آنها در حقیقت سه ارگانیسم زیر گونه از یک باکتری یکسان باشند (54و10).
بین همه ی گونه های بوردتلا، فقط بوردتلا پرتوسیسPT را سنتز می کند. اگرچه کروموزوم بوردتلا پاراپرتوسیس و بوردتلا برونشیسپتیکا دارای لوکوس ژنPT است اما رونویسی آنها بدلیل پروموتور ناقص خاموش می باشد. در فاز حاد، هر سه ارگانیسم فاکتورهای ویرولانس مشابه ایجاد می کنند.
بعضی از تحقیقات عدم وجود اطلاعات در مورد این بیماری را تا قبل از قرن 16 میلادی ناشی از سازگاری ارگانیسمهای حیوانی با انسان در 5 قرن گذشته میدانند. اگرچه شواهد اخیر نشان میدهد که ارتباط بوردتلا پرتوسیس با انسان ها ممکن است قدیمیتر از آنچیزی باشد که قبلاً تصور می شد (54).
اخیراً سویه هایی از پرتوسیس شناسایی شده اند از جمله بوردتلا هولمسی9 که در بیماران واجد نقص ایمنی10 منجر به باکتریمی11، اندوکاردیت12 و بیماری های تنفسی می گردد. سویه دیگر می توان از بوردتلا هینزی13 نام برد که از خون بیمار مبتلا به ایدز و همچنین از ترشحات دستگاه تنفسی بیمار مبتلا به سیستیک فیبروزیس14جدا شده است. اگرچه بسیاری از فعالیت های بیولوژیکی بوردتلا پرتوسیس از مدت ها پیش مشخص شده بود اما تلاش ها برای یافتن ترکیبات مسئول هر یک از فعالیت های متنوع این ارگانیسم برای سال ها ناموفق باقی ماند. بهر حال وقتی ترکیبات و اجزای اختصاصی ارگانیسم مشخص شد نه تنها باعث افزایش درک پاتوژنیسیته بیماری شد بلکه در نهایت منجر به خالص سازی این اجزاء و تولید واکسن غیرسلولی سیاه سرفه15 شد (18).
بوردتلا پرتوسیس تمایل ویژه ای برای اتصال شدید به سلول های پوششی مژه دار16 در مجاری تنفسی دارد. باکتری ممکن است وارد سلول های پوششی شود اما بطور معمول نمی تواند وارد سلول های غشاء پایه17 شده و یا به داخل گردش خون تهاجم نماید (شکل1-2). به هر حال توکسین های تولید شده توسط باکتری می تواند به جریان خون وارد شده و عوارض سیستمیک را ایجاد نماید. آنتی ژن های بوردتلا پرتوسیس که در واکسن های غیر سلولی بکار می رود و همچنین سایر آنتی ژن های این باکتری در جدول 1-1 ذکر شده است (18).
شکل1-2. اتصال بوردتلا پرتوسیس به سلول های پوششی مژه دار مجاری تنفسی
جدول 1-1 . آنتی ژن های مختلف باکتری سیاه سرفه
اجزا تشکیل دهندهفعالیتهای بیولوژیکیتوکسین پرتوسیس(PT) Pertussis Toxinاگزوتوکسین ترشحی که لنفوسیتوز ، حساسیت به هیستامین ، فعال سازی سلول های جزیره ای پانکراس و تقویت ایمنی را تحریک می کندفیلامنتوس هماگلوتینین
Fillamataus Hemaglutininدر اتصال باکتری به سلول مژه ای اپیتلیوم در مجاری تنفسی دخالت داردفیمبریه Fimbriaeدر اتصال باکتری به سلول مژه ای اپیتلیوم در مجاری تنفسی دخالت داردپرتکتین Pertactinپروتئین غشای خارجی که موجب تسهیل اتصال باکتری به سلول مژه ای اپیتلیوم تنفسی می شودBrkAپروتئین غشای خارجی که نقش واسطه برای اتصال به سلول های اپیتلیوم را داشته و در مقابل کمپلمان مقاومت می کندآدنیلات سیکلاز Adenylate Cyclaseمانع عملکرد فاگوسیتوز می شوداندوتوکسین Endotoxineموجب تب می شود و واکنش موضعی در حیوان و احتمالاً انسان را منجر می شودتراکئال سایتوتوکسین Tracheal Cytotoxinمنجر به استاز و اثرات سایتو پاتیک در موکوس تراکئال می شوددرمونکروتیک یا توکسین ناپایدار به گرما Dermonecrotic Or Heat Labile Toxinباعث نکروز پوستی و انقباض عروق در حیوانات می شود
1-4.ترکیبات مهم باکتری سیاه سرفه
بوردتلا پرتوسیس دارای دو دسته عوامل ویرولانسی می باشد :
دسته اول را ادهسین هایی تشکیل میدهند که شامل فیلامنتوس هموگلوتینین، پرتکتین، فیمبریه و BrkA هستند که در اتصال باکتری به سلولهای مژکدار دستگاه تنفسی فوقانی و ماکروفاژها دخیل هستند.
دسته دوم عوامل ویرولانسی باکتری، توکسین هایی هستند که در آسیب موضعی و سیستمیک به میزبان شرکت داشته و شامل پرتوسیس توکسین، آدنیلات سیکلاز توکسین، تراکئال سایتوتوکسین، درمونکروتیک توکسین و اندوتوکسین می باشد (1).
1-4-1. توکسین پرتوسیس
قبلاً به توکسین پرتوسیس یا PT 18 فاکتور تحریک کننده لنفوسیتوز‌19 (LPF) می گفتند، که مهمترین عامل پاتوژنز سیاه سرفه بود و به طور عمومی باور بر این است نقش مهمی در القاء و ایجاد ایمنی بالینی دارد. PT یک ساختار اولیگومری مرکب از 5 ساب یونیت20 مختلفS1 تا S5 است. به طور ساختاری PT به کلاس A-B از توکسین باکتریایی تعلق دارد. جزءS1 پروموتوری است که ریبوزیلاسیون ADP از پروتئین های اتصالی تنظیمیGTP21 را که در انتقال سیگنال در سلول یوکاریوت نقش دارد کاتالیز می کند. پروموتورA یا همان جزءS1 تا حد زیادی مسئول سازماندهی فعالیت های بیولوژیکیPT شامل ارتقاء لنفوسیتوزیس22، تحریک سلول های جزیره ای پانکراس23، حساسیت به هیستامین، کلاسترینگ24 سلول های CHO 25و خاصیت ادجوانی آن می باشد. اولیگومرB ساختار حلقه ای شکل است که محتوی یک کپی از هر یک از ساب یونیت های S2 ، S3 ، S5 و دو کپی ازS4 است. وظیفه مهم اولیگومر B تسهیل اتصال PT به سلول‌های مژه‌دار مخاط مجاری تنفسی است. علاوه بر آن اولیگومر B فعالیت‌های آنزیمی نظیر هموگلوتیناسیون26و میتوژنیسیتی27 سلول‌های لنفوسیت T را نیز دارا می‌باشد.
شکل1-3. شمای شماتیک از پرتوسیس توکسین
کل مولکول PT برای اکثر فعالیت‌های آنزیمی پروموتور A لازم می‌باشد، از اینرو پروموتور A در غیاب الیگومر B هیچ‌گونه عملکردی نخواهد داشت. سویه‌های مختلف بوردتلاپرتوسیس که از نظر تولید آگلوتینین مختلف می‌باشند همگی یک نوع PT را تولید می‌کنند که PT تولیدی واجد خواص سرولوژیکی و بیولوژیکی یکسانی می‌باشد (56و47).
PT توسط بوردتلا پاراپرتوسیس یا برونشی سپتیکا تولید نمی‌شود، اگرچه این ارگانیسم‌ها محتوی ژن‌هایی هستند که می‌تواند فرم فعال PT را در این میکروارگانیسم ها کد کند، اما پروموتورهای این ژن‌ها غیر فعال بوده و لذا توکسین تولید نمی‌شود (30).
PT چندین نقش اصلی را در بیماری‌زایی پرتوسیس دارد، اگرچه مکانیسم‌های دقیق عملکرد آن چندان واضح نمی‌باشد. PT اتصال بوردتلا پرتوسیس به سلول‌های مژه‌دار مجاری تنفسی را تسهیل می‌نماید و در توکسیسیتی28 سلول دخالت دارد. همچنین PT در کلونیزاسیون سلول باکتری در مجاری تنفسی از طریق جلوگیری از مهاجرت نوتروفیل و نقش‌آفرینی آنها در طول اولین هفته بعد از عفونت و جلوگیری از پاکسازی اولیه باکتری توسط آنتی‌بادی نقش دارد.
به نظر می‌رسد که PT استراتژی خاصی را برای بروز عفونت حاد و تداوم دوره عفونت حتی در حضور آنتی بادی برای هجوم باکتری فراهم می‌نماید. و جالب‌تر اینکه تزریق داخل وریدی PT در افراد داوطلب بالغ هیچ‌گونه عوارضی را ایجاد نمی‌کند (48).
PT یک ایمونوژن قوی است و آنتی‌بادی‌ها برعلیه PT نقش مهمی را در ایمنی بالینی برعلیه سیاه‌سرفه ایفا می‌کنند. در آزمایشگاه تزریق آنتی‌بادی‌های PT به موش‌ها منجر به ایجاد ایمنی در آنها برعلیه تست چلنج داخل مغزی باکتری زنده (تست کندریک29) و یا تست چلنج استنشاقی30‌می شود (56و57).
چلنج موش‌هایی که به طور فعال با تزریق ساب‌یونیت‌های PT ایمن شده و یا به طور غیرفعال با آنتی‌بادی‌های مونوکلونال علیه ساب‌یونیت‌های PT گوناگون ایمن شده اند، نشان می‌دهدکه کل مولکول PT برای ایجاد ایمنی مناسب لازم و ضروری است. توکسوئید PT تولید شده به روش شیمیایی یا ژنتیکی به عنوان جزئی از واکسن غیرسلولی سیاه‌سرفه به‌کار می‌رود (48).
1-4-2. فیلامنتوس هموگلوتینین (FHA)
FHA 31 یک مولکول سنجاقی شکل بزرگ است که ابتداء به صورت یک Precursor با وزن مولکولی 367 کیلو دالتونی ساخته شده و سپس با شکست مولکولی در دو طرف به فرم بالغی از پروتئین با وزن 220 کیلو دالتون تبدیل می‌شود.
مطالعات آزمایشگاهی بیان می‌کند که FHA یک ادهسین32 با 4 دومن اتصالی مجزا است که اتصال به مونوسیت‌ها، ماکروفاژها، سلول‌های اپیتلیوم مژه‌دار و حتی سلول‌های غیرمژه‌دار اپیتلیوم تنفسی را تسهیل می‌کند (63).
داده ها نشان میدهد کهFHA نقش ایمونومدولاتوری نیز دارد. اثر متقابل FHA با رسپتورهای ماکروفاژها ترشح اینترلوکین12را از طریق مکانیسم اینترلوکین10 سرکوب می‌نماید که این امر منجر به عدم پاسخگویی Th1 و درنهایت پایداری باکتری در بدن می‌گردد (39). ژن ساختمانی هماگلوتینین کلون شده است و از طریق مهندسی ژنتیک قادر هستند که آن راجهت استفاده در واکسن های جدید تولید کنند (2).

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب(به صورت کاملا تصادفی و به صورت نمونه) با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود-این مطالب صرفا برای دمو می باشد

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

باکتری‌های موتاسیون یافته فاقد FHA قدرت ناچیزی در باند شدن به سلول‌های پوششی تنفسی دارند. ایمن کردن موش‌ها با FHA آنها را در مقابل چلنج تنفسی با باکتری زنده سیاه‌سرفه محافظت می‌نماید اما در مقابل چلنج داخل مغزی با باکتری زنده سیاه‌سرفه بی‌تأثیر است.
با اینحال FHA یک ایمونوژن قوی است و آنتی‌بادی‌های سرمی علیه FHA بعد از عفونت طبیعی و واکسیناسیون با واکسن‌های حاوی این پروتئین ظاهر می‌شود. نتایج یکی از مطالعات اپیدمیولوژی در فنلاند حاکی از این است که آنتی‌بادی‌های FHA در دانش‌آموزان با حفاظتشان در برابر بیماری سیاه سرفه مرتبط است (65).
1-4-3. فیمبریه و آگلوتینین‌ها
فیمبریه33 پروتئینی پلی‌مریک و فیلامنتوس34 است که توسط باکتری سیاه‌سرفه به صورت خارج سلولی بیان می‌شود. بیش از دوازده آگلوتینوژن35در غشاء خارجی سلول باکتری سه گونه ی مختلف از جنس بوردتلا وجود دارد که دو نوع شناخته شده از این آگلوتینوژن‌ها، فیمبریه نامیده می‌شود. بر این اساس دو واژه آگلوتینوژن و فیمبریه مشابه یکدیگر نبوده و نباید بجای یکدیگر به کار روند.
الگوی آگلوتینوژن در میان سه گونه بوردتلا با هم فرق می‌کند. حدود هشت آگلوتینوژن در بوردتلاپرتوسیس یافت شده است که از این تعداد 6 آگلوتینوژن در این گونه اختصاصی بوده و از این شش آگلوتینوژن، سه آگلوتینوژن 1، 2 و 3 در بیماری‌زایی و ایمنی علیه بیماری اهمیت دارند (18).
آنتی‌بادی‌ها علیه این آگلوتینوژن ها در مطالعات سرواپیدمیولوژی بکار می‌روند. مطالعات In vivo نشان می‌دهد که سویه‌های بوردتلاپرتوسیس توانایی تکثیر در مجاری تنفسی36 و تراکئای موش37 را ندارند. سویه‌های بوردتلا برونشی سپتیکا عاری از فیمبریه نیز با اینکه قادر به بیان FHA و دیگر ادهسین‌ها هستند در کلونیزاسیون لوله تنفسی حیوان ناتوان می باشند (14).
آنتی‌بادی‌های سرمی علیه فیمبریه معمولاً بعد از بیماری طبیعی یا ایمنی فعال با واکسن محتوی این پروتئین‌ها ایجاد می‌شود. شواهد زیادی دال بر نقش آنتی‌بادی آگلوتینوژن‌ها در ایجاد ایمنی بالینی وجود دارد.
مؤید این نقش کاهش توانمندی آن دسته‌ از واکسن سلولی سیاه‌سرفه که آگلوتینوژن‌های موجود در واکسن با آگلوتینوژن‌های سویه‌های سیاه‌سرفه شایع همسان نمی‌باشد، خواهد بود.
شواهد آزمایشگاهی وجود دارد که وجود نوعی تغییر38 آنتی ژنیک را در سروتایپ های باکتری سیاه‌سرفه پس از کشت‌های متوالی نشان می‌دهد. همچنین شواهدی وجود دارد که نشانگر بروز تغییرات سروتیپی این باکتری در طول بروز بیماری در بیماران می باشد.
داده‌های سرواپیدمیولوژی39 از کشور انگلستان نشان داد که بین سال‌های 1941 و 1953 سویه‌های رایج بوردتلاپرتوسیس محتوی آگلوتینوژن های 1، 2، 3 بوده‌اند. در حالیکه این مطالعات در سال 1968 نشان داد که 75% از سویه‌های بوردتلاپرتوسیس جدا شده در این کشور تنها واجد دو نوع آگلوتینوژن 1و2 بوده‌اند. دلیل این امر شاید کمبود آگلوتینوژن 3 در واکسن‌های مصرف شده در این برهه از زمان می باشد. واکسنی که واجد آگلوتینوژن 3 بیشتری بوده است توانمندی بیشتری نسبت به سایر واکسن‌ها در پیشگیری از بیماری در این مقطع زمانی داشته است (9).
البته امکان دارد که تفاوت در سروتیپ‌های سیاه‌سرفه که براساس آگلوتینوژن‌ها می‌باشد در درون خود تفاوت هایی را نیز در سایر مارکرهای آنتی‌ژنیک داشته باشد. اما قدر مسلم این است که این تفاوت در سایر آنتی‌ژن‌ها، نظیر PT را شامل نخواهد شد، چراکه PT در تمام سویه‌های سیاه‌سرفه یکسان می‌باشد.

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

نتایج حاصل از بیماری در انسان، مدل موشی و تحقیقات آزمایشگاهی نشان داد که آنتی‌بادی علیه فیمبریه (FIM) نقش مهمی را در ایجاد ایمنی علیه بیماری ایفاء کرده است.
از آنجا که آگلوتینوژن‌ها نقش مهمی را در القاء ایمنی برعلیه بیماری سیاه‌سرفه دارا می‌باشند سازمان جهانی بهداشت (WHO)توصیه کرده است که واکسن سیاه‌سرفه سلولی محتوی آگلوتینوژن 1، 2 و 3 باشد و اخیراً دارا بودن دو نوع آگلوتینین 1و 2 را ضروری دانسته اند (21).
1-4-4. پرتکتین
پرتکتین40یا PRN که در ابتداء پروتئین 69 کیلو دالتونی41 نامیده می‌شد، پروتئین سطحی است که پس از تحمل یک برش پروتئولیتیکی به غشاء خارجی سلول فرستاده می‌شود. پروتئین‌های مشابهی نیز توسط بوردتلا پاراپرتوسیس و برونشی سپتیکا تولید می‌شوند.
PRN بواسطه موتیف (RGD) Arg- Gly- Asp، اتصال باکتری به سلول یوکاریوت و سپس تهاجم به آن را تسهیل می‌نماید. PRN بسیار ایمونوژنیک است. آنتی‌بادی علیه PRN بعد از بیماری طبیعی یا ایمنی فعال با واکسن‌های محتوی این پروتئین تولید می‌شود (63).
موش‌هایی که بطور غیرفعال با آنتی‌بادی‌های PRN ایمن شده‌اند مقاومت بالایی در چلنج با آئروسل کشنده سویه ویرولانت بوردتلا پرتوسیس دارند. اگرچه در چلنج داخل مغزی موش‌های ایمن شده با PRN تنها زمانی که با FHA نیز ایمن شده باشند، مقاومت می‌نمایند (50).
مطالعاتی که در هلند انجام شده است نشانگر وجود تغییرات ژنتیکی در مولکول‌های PRN (و حتی PT) بوده که منجر به تغییر آنتی ژنیک سویه‌های رایج به سمت واریانت‌هایی شده است که در واکسن استفاده شده در جامعه حضور ندارند (18).
مطالعات بعدی در مدل موشی نشان داد که واکسن سیاه‌سرفه سلولی هلندی اثر کمتری را در مقابل ویرولانت‌های PRN نسبت به سایر ویرولانت‌ها دارا می‌باشد. در مقابل انستیتو سانوفی پاستور فرانسه طی یک مطالعه اعلام نمود که ژنوم باکتری استفاده شده در واکسن لیوفیلیزه چندگانه سیاه‌سرفه این مرکز با گذشت سال‌ها از ذخیره‌سازی آن در سال 1984 تا 2002 تغییری نیافته و کلیه توکسین‌ها و ادهسین‌ها را نیز تولید می‌نماید (49).
مطالعه همین تحقیق نشان داد Lotهای مختلفی از این واکسن در موش بسیار ایمنی‌زا بوده‌اند. علاوه بر موارد فوق مطالعات دیگری در سایر مناطق دنیا به منظور تعیین تأثیر فشار انتخابی محیط42 و ارتباط آن با ایجاد واریانت‌های مختلف مولکول PRN از باکتری سیاه‌سرفه و متعاقب آن کاهش کارائی واکسن صورت گرفته است. از جمله این مطالعات می‌توان از مطالعه‌ای در کشور سوئد نام برد که به منظور ارزیابی سویه‌های واکسینال بین سال‌های 1970 تا 2003 انجام گرفت، که مؤید این نکته است که هیچگونه کاهش کارائی واکسن که ناشی از پلی‌مورفیسم باکتری باشد، مشاهده نشده است (27).
از آنجا که در این کشورها از واکسن غیر سلولی سیاه‌سرفه با ترکیبات مختلف استفاده می‌شود، هنوز به درستی مشخص نیست که آیا این تغییرات آنتی‌ژنیک در باکتری ناشی از غلظت بالای سایر آنتی‌ژن‌های سیاه‌سرفه نسبت به PRN در واکسن غیر سلولی باشد (18).
1-4-5. آدنیلات سیکلاز 43(ACT)
آدنیلات سیکلاز در همه‌ی سویه‌های ویرولانت بوردتلا پرتوسیس وجود داشته و به صورت یک پروتو توکسین مونومر44 سنتز می‌شود و بعد با ایجاد یک برش به مولکولی فعال تبدیل گشته که قادر است به درون بسیاری از سلول‌های یوکاریوت وارد شود و به محض ورود به آن سلول آدنیلات سیکلاز توسط کالمودلین45 فعال شده و تولید Cyclic AMP را به میزان زیادی کاتالیز ‌نماید. آدنیلات سیکلاز مانع کموتاکسی46،کمیلومینسنس47و تولید آنیون سوپراکسیداز توسط مونوسیت‌ها و نوتروفیل‌ها در آزمایشگاه می‌شود و در شرایط In vivo تولید Cyclic AMP را از ATP در درون فاگوسیت افزایش داده و با انباشتگی بیش از حد Cyclic AMP عملکردهای متعدد و فاگوسیتوز را متوقف می‌نماید (38و33).
مطالعات اخیر نشان داد که اثر سایتوتوکسیسیتی48آدنیلات سیکلاز روی ماکروفاژها ممکن است ناشی از القا آپاپتوزیس49 در سلول ماکروفاژ باشد نه اینکه منحصراً در اثر انباشتگی بیش از حد Cyclic AMP درعملکردهای متعدد فاگوسیتوز را متوقف نماید (32).
سایر مطالعات In vivo نشان می‌دهد که سویه‌های وحشی در اثر موتانت‌هایی با جهش در آدنیلات سیکلاز توانایی ایجاد بیماری کشنده را ندارند.
این یافته‌ها اثبات می‌کند که آدنیلات سیکلاز مانند یک فاکتور آنتی اینفلامنتوری50و آنتی فاگوسیتوز51در طول عفونت ایفای نقش می‌کند. چلنج استنشاقی موش با آئروسل باکتری در حضور PT و آدنیلات سیکلاز نشان داد که PT و آدنیلات سیکلاز بیشترین نقش را به عنوان فاکتور ویرولانت دارا بودند.
ایمن‌سازی فعال موش با آدنیلات سیکلاز موجب حفاظت موش‌ها در مقابل چلنج داخل مغزی و استنشاقی سویه حاد می‌شود. این ایمنی حاصل شده، مشابه ایمنی واکسیناسیون با واکسن سلولی سیاه‌سرفه بوده است. علاوه بر آن، نشان داده شد که آنتی‌بادی علیه آدنیلات سیکلاز از تکثیر باکتری سیاه‌سرفه در مدل موشی ممانعت می‌نماید (24).

About 92

پاسخ دهید